Editing Error Correction in Gene Synthesis (section)

== PreCR Repair Mix components ==

Taq DNA Ligase

Endonuclease IV 

Bst DNA Polymerase 

Fpg Uracil-DNA Glycosylase (UDG) 

T4 PDG (T4 Endonuclease V) 

Endonuclease VIII&nbsp;

Reaction Conditions: DNA template, 100 µM dNTPs, 1X ThermoPol Reaction Buffer, 1X NAD+ and 1 µl PreCR Repair Mix in a total reaction volume of 50 µl. Incubate at 37°C. 

1X ThermoPol Reaction Buffer: 10 mM KCl 10 mM (NH4 )2 SO4 20 mM Tris-HCl 2 mM MgSO4 0.1%Triton X-100 pH 8.8 @ 25°C 1



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0008] (1)称取芹菜，每Ikg芹菜加入80〜120ml缓冲液A，捣成勻浆，压榨出液体，过滤， 用IM的Tris溶液调节pH至8. 0左右，得粗酶液；

[0009] (2)将粗酶液在45〜50°C下保温15〜20min，然后3000 X g〜5000 X g离心20〜 40min，取上清液；

[0010] (3)加入硫酸铵粉末至饱和度为25%，3000Xg〜5000Xg离心20〜40min，收 集上清液；所得上清液中加入硫酸铵粉末至饱和度为80%，3000Xg〜5000Xg离心20〜 40min,收集沉淀物；

[0011] (4)将所得沉淀物用缓冲液B溶解，透析脱盐；

[0012] (5)加入刀豆凝集素，混勻，4〜10°C下搅拌6〜16小时使CEL I核酸酶与刀豆凝 集素充分结合，然后静置20〜60min ；

[0013] (6)抽滤去清液，在滤渣中加入缓冲液C溶解出CEL I核酸酶，超滤浓缩。在4〜10°c条件下，上DEAE-S印harose FF,然后依次用洗脱液D和洗脱液E各500ml以0. 5〜 lml/min的流速进行梯度洗脱；

[0014] (7)收集洗脱液，用RF-I Nicking方法检测各收集管中的CEL I核酸酶活力，合并 酶活力在3 X 107U/mg蛋白的洗脱液；

[0015] 上述步骤中，所述缓冲液A由以下方法制备得到：在pH8. 0的0. IM Tris-HCl缓 冲液中添加N2SO3和苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)至浓度分别 为0. OlM和ImM ；所述缓冲液B由以下方法制备得到：在pH8. 0的0. IM Tris-HCl缓冲液 中添加苯甲基磺酰氟至浓度为ImM;所述缓冲液C由以下方法制备得到：在pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至浓度分别为30mM和0. 01%;所述 洗脱液D由以下方法制备得到：在pH8. 0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KCl至浓度分别为10mM、0. 01%和IOmM ；所述洗脱液E由以下方法制备得到：在 pH8. 0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KCl至浓度分别为10mM、 0. 01% 和 0. 5M。

[0016] 本发明方法在抽提液中采用添加少量亚硫酸钠减少和清除提取液中有色物质；采 用热变性的物理方法，快速清除大量耐温性差的杂蛋白；利用CEL I是糖蛋白能与活化的 刀豆凝集素结合的特点，使CEL I核酸酶与刀豆凝集素结合除去其他杂蛋白，使CEL I得到 进一步的的纯化；最后选择DEAE-S印harose FF作为适宜介质进行一次层析纯化出CEL I。 综上，本发明方法抛弃了现有方法中的多次高速或超速离心以及多次凝胶过滤和离子交换 层析的手段，采用合适的物理化学方法达到快速将CEL I核酸酶从芹菜中提取出来并纯化 的目的。

[0017] 本发明方法提取CEL I核酸酶的效率较高，每100千克芹菜经步骤1后可得总粗 酶活力1.81X107，比活9.5X102U/mg蛋白的粗酶液，继续经步骤⑵〜（7)分离纯化后可 得纯的CEL I核酸酶1.545 X IO6〜1.895 X IO6U,酶活回收率达到8. 54〜10. 47% ；所得酶 的纯度达电泳纯，酶比活可达3X 107U/mg蛋白。本发明方法与经典的Yang等人的方法相 比，所得酶的纯度及比活没明显差异，但回收率提高了 5倍以上。

[0018] 附图说明

[0019] 图1是本发明方法提取核酸酶CEL I的SDS-PAGE图。

[0020] 图2是本发明方法提取核酸酶CEL I的酶切鉴定图。

具体实施方式

[0021] 例 1

[0022] 1、制备

[0023] 称取市场上购买的西芹（即西洋芹菜）100千克，去掉叶片，加入缓冲液A 8L，捣 成勻浆，榨出滤液74L。用IM Tris水溶液液调整滤液的pH至8. 0(Tris液用量为7. 5L)， 然后在50°C条件下保温20分钟后置于冰水中冷却；5000 Xg离心40分钟，去掉残渣，取上 清液；一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末（每升约加入144g)至25%的饱和度，5000Xg离 心40min，去掉沉淀，收集上清液，一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80&nbsp;%的饱和度（每升约 加入390g)，在5000 X g条件下离心40min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于8L缓冲液B 中，用同样的Tris缓冲液透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200ml (已活化，且用缓冲液B平衡），4°C下搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置1小时，用抽滤漏斗去掉清 液，加入缓冲液C 300ml (分5次进行），充分混勻，使酶溶于缓冲液中，过滤；滤液使用超滤 膜浓缩（分子量截留10000道尔顿)至30ml，上DEAE-S印harose FF柱（30mmX 400mm)，以 缓冲溶液D和E各500ml作洗脱液，采用TH-500梯度混合仪（上海沪西分析仪器厂生产） 进行梯度洗脱，洗脱流速为0. 5ml/min,每Smin收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检 测CELI活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条 带的活力高峰管酶液，此洗脱液即为CEL I核酸酶蛋白洗脱液，共获得酶液20ml。

[0024] 2、鉴定

[0025] (1)所得酶液用SDS-PAGE检测，在4.3kDa处可见一蛋白条带，说明所得酶液应为 CEL I核酸酶，纯度达电泳纯（见图1)。

[0026] (2)蛋白质含量分析按考马斯亮蓝法测定。其原理是考马斯亮蓝G-250在游离 态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在 595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0〜100 μ g/ml)，蛋白质-色素结合物在595nm波长下 的光吸收与蛋白质含量成正比。

[0027] (3)所得酶液采用RF-I Nicking方法测定酶活。该方法以pUC 19为底物，用不同 浓度的酶液切割，切割产物经电泳后用Gel-PRO Analyzer凝胶定量分析软件分析RF I,RF II和RF III各区带荧光强度响应值。如图2所示，栏1为Lambda DNA/Hind IIIDNA分子 量标样，栏2为RF I形式的pUC19质粒对照，用2 μ 1水代替酶液；栏3〜7分别为反应体 系中加入2μ1不同浓度的CEL I提取酶液。由于在一定酶浓度范围内区带的荧光强度与 酶活性线性相关，利用公式I计算得出CEL I核酸酶的比活。

[0028] 酶活力

结果计算结果，所提取酶液每毫升含蛋白3. 158yg、酶活力为94750U，酶的比活 为3. 032 X 107U/mg蛋白；20ml提取液中酶的总活力1. 895 X IO6U, CEL I核酸酶回收率达到 10. 47%。

[0030] 例 2

[0031] 称取市场上购买的本芹（即中国芹菜）100千克，去掉叶片，加入缓冲液A 12L，捣 成勻浆，榨出滤液77L。用IM Tris水溶液液调整滤液的pH至8. 0(Tris液用量为7. 3L)， 然后在50°C条件下保温15分钟后置于冰水中冷却；3000 Xg离心20分钟，去掉残渣，取上 清液；一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末（每升约加入144g)至25%的饱和度，3000Xg离 心20min，去掉沉淀，收集上清液，一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80&nbsp;%的饱和度（每升约 加入390g)，在3000 X g条件下离心20min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于8. 2L缓冲液 B中，用缓冲液B透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200ml (所用刀豆凝集素已活化， 且用缓冲液B平衡），4°C下搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置20分钟，用抽滤 漏斗去掉清液，加入缓冲液C 280ml (分7次进行），充分混勻，使酶溶于缓冲液中，过滤；滤 液使用超滤膜浓缩（分子量截留10000道尔顿）至30ml，上DEAE-S印harose FF柱【柱场 为30mm (直径）X 400mm (高）】，采用TH-500梯度混合仪（上海沪西分析仪器厂生产）进行 梯度洗脱，洗脱流速为lml/min，每Smin收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检测CEL I活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条带的活 力高峰管酶液，此洗脱液即为CELI核酸酶蛋白洗脱液，共获得酶液24ml。按例1方法检测， 每毫升酶液含蛋白2. 138 μ g、酶活力为64400U，酶的比活力为3. OlXlO7 ；24ml提取液酶的 总活力为1. 545X IO6U, CEL I核酸酶回收率为8. 54%。用SDS-PAGE检测，达电泳纯核酸酶 CEL I。

[0032] 例 3

[0033] 称取市场上购买的西芹100千克，去掉叶片，加入缓冲液A 10L，捣成勻浆，榨出滤 液。用IM Tris水溶液调整滤液到pH至8. 0，然后在50°C下保温18分钟后置于冰水中冷 却；4000Xg离心30分钟，去掉残渣，取上清液；一边搅动一边缓慢加入硫酸铵粉末至25% 的饱和度，4000 X g离心30min，收集上清液，一边搅拌一边加入硫酸铵粉末至80&nbsp;%的饱和 度，在4000 X g条件下离心30min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀溶于7L缓冲液B中，用同样 的Tris缓冲液透析脱盐。脱盐后溶液加入刀豆凝集素200mL(已活化，且用缓冲液B平衡）， 4°C下搅拌过夜，使酶与刀豆凝集素充分结合。静置40分钟，抽滤去掉清液部份，加入缓冲 液C 300ml (分5次进行），充分混勻，使CEL I核酸酶溶于缓冲液中，过滤；滤液使用超滤 膜浓缩（分子量截留10000道尔顿)至100ml，上DEAE-S印harose FF柱【柱场为30mm (直 径)X400mm(高）】，采用TH-500梯度混合仪（上海沪西分析仪器厂生产)进行梯度洗脱， 洗脱流速为0. 6ml/min,每8min收集一管洗脱液；用RF-I Nicking方法检测CEL I活力高 峰管，再用SDS-聚丙烯凝胶电泳法检测其蛋白纯度，之后合并蛋白为单一条带的活力高峰 管酶液，此洗脱液即为CEL I核酸酶蛋白洗脱液，获得酶液19. 2ml。按例1方法检测，每ml 酶液含蛋白3. 091^、酶活力为92687仏测得酶比活为3\10力/11^蛋白；19. 2ml酶提取液酶 的总活为1. 78X IO6U, CEL I核酸酶回收率达9. 83%。用SDS-PAGE检测，达电泳纯核酸酶 CELI。
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